ניתוח רצפי מיטוכונדריה לבדיקת מודלים של אבולוציה אנושית

 

תרגיל כיתה בניתוח רצפי דנ"א ניאנדרטלי

                                ( http://geneticorigins.org/mito/mitoframeset.htm- תורגם מ )

מאז התגלו לראשונה בעמק הניאנדר בגרמניה בשנת 1856, העצמות הכבדות של האדם הניאנדרטלי ריתקו את המדענים, כמו גם את הציבור הרחב. הניאנדרטל היה חבר קדום בסוג הומו, שחי באירופה החל לפני כ-300,000 שנה ונכחד לפני כ-30,000 שנה. ברור שבחלק מאזור התפוצה שלו על פני כדור הארץ, הניאנדרטל חלק את בית הגידול האירופאי שלו עם בני אדם מודרניים (Homo sapiens). זה זמן רב קיימת מחלוקת אם הניאנדרטל היה האב הקדמון הישיר של בני האדם המודרניים או לא. לחלופין, אם הניאנדרטל וההומו סאפיינס היו נפרדים, האם הייתה חילופי גנים משמעותיים בין שתי האוכלוסיות?

על פי המודל הרב-אזורי, בני אדם מודרניים התפתחו במקביל מכמה אוכלוסיות ארכאיות שונות שחיות בחלקים שונים של העולם. לפי מודל זה, הניאנדרטל היה האב הקדמון של האירופאים המודרניים, בעוד שאדם ג'אווה (Homo erectus) היה האב הקדמון של האסיאתים המודרניים.

על פי מודל העקירה, המוכר יותר כ"מחוץ לאפריקה", הומו סאפיינס צמח מאוכלוסייה מייסדת אחת שהגיחה מאפריקה ב-100,000-200,000 השנים האחרונות. קבוצה זו היגרה ברציפות לאירופה ואסיה, ודחקה את ההומינידים הקדומים יותר.

בשנת 1997, צוות מחקר בינלאומי בראשותו של Svante Paabo,שזכה לאחרונה בפרס נובל, הוציא DNA מעצם הזרוע של דגימת הניאנדרטלי המקורית, שיכפל את הדגימה באמצעות PCR, ושיבט את התוצרים שהתקבלו ב-E. coli. לאחר מכן נעשה שימוש במקטעים המשובטים לשחזור רצף של 379 בסיסים של אזור הבקרה המיטוכונדריאלי. בתרגיל זה נשתמש ב- DNA Sequence Server. DNA באתר האינטרנט של מרכז הלמידה של DNA במעבדת Cold Spring Harbor בארה"ב, כדי לשחזר את המחקר הזה ולענות על השאלות שהוצגו לעיל. אתם תקבלו רצפי אזור בקרת mt ממספר מקורות ולאחר מכן תעבירו אותם אל סביבת העבודה של הניתוח של עמוד שרת רצפי ה-DNA.

א. גלו את את המספר הממוצע של הבדלי נוקלאוטידים באזור הבקרה של mt בין ניאנדרטלי ל-5 בני אדם מודרניים במסד הנתונים של DNALC עצמו.

1. יש לכוון את דפדפן האינטרנט שלך ל-DNA Sequence Server. היכנסו ל- Sequence Server כאורח או באמצעות חשבון רשום. מומלץ להדפיס הוראות אלה כדי שתוכלו לבצע את ההוראות הללו מבלי לעבור בין שני חלונות.

2. לחצו   על הכפתור "MANAGE GROUPS" כדי לפתוח חלון חדש שבו תוכלו לצפות ברצפי אזורי השליטה של mt שנמצאים כעת במסד הנתונים של שרת רצפי ה-DNA.

3. השתמשו בתפריט הנפתח בפינה הימנית העליונה כדי לבחור ולהציג רשימה של כיתות סטודנטים ו/או מספר סדנאות מורים. כל שיעור או סדנה מכילים עד 30 רצפי DNA בודדים.

4. לחצו בתיבת הסימון כדי לבחור שיעורים או רצפי סדנאות שברצונך להפוך לזמינים לניתוח (לדוגמה, שנת 2000, "Genomic Biology Workshop"). (אם תרצו, לחצו כדי לפתוח חלון חדש המציג את הרצפים בקבוצה שנבחרה).

5. בחלון "Manage Groups", בחרו "Ancient DNA" מהתפריט הנפתח בפינה הימנית העליונה.

6. לחצו בתיבות הסימון כדי לבחור DNA אנושי מודרני או DNA אנושי פרהיסטורי או כדי לגשת לרצפי DNA מיטוכונדריאלי מאינדיאנים אמריקאים, אפרו-אמריקאים, אירופאים, אפריקאים, אסייתים, אבוריג'ינים אוסטרליים, כמו גם האדם הניאנדרטלי ו-Mungo Man.

7. לחצו על אישור. החלון ייסגר, והקבוצה שנבחרה תופיע כעת בסביבת העבודה של שרת הרצפים.

8. בסביבת העבודה של שרת הרצפים, בדקו חזותית את האיכות של מספר רצפים של תלמידים או מורים באופן הבא:

השתמשו בתפריט הנפתח המציג את השמות לדוגמה (למשל Teacher 001) כדי לבחור רצף של תלמיד או מורה. לאחר מכן, לחצו על התיבה "Open" הסמוכה כדי להציג חלון חדש המציג את רצפי הנוקלאוטידים של הערך שנבחר.

כל רצף יכלול נוקלאוטידים (A,T,C,G) שביניהם תופיע לעיתים האות N, במקרים שלא ניתן היה לקבוע את זהות הנוקלאוטידים בעמדות אלו. ברצפים "טובים", שבהם תנאי הניסוי היו קרובים לאופטימליים, לרצף יהיו מעט מאוד N, אם בכלל.

במקרים לא אופטימליים, מספר רב של N יהיה מפוזר לאורך הרצף.

במידת האפשר, השתמשו ברצפים "טובים" (אלו ללא N פנימי) בהשוואות הבאות שלכם.

9. כעת, השוו את הרצף הניאנדרטלי לרצף מודרני באמצעות אלגוריתם ClustalW הזמין ב-Sequence Server Workspace. לחצו על תיבות הסימון משמאל לרצף הניאנדרטלי ולרצף אחד של תלמיד או מורה. מעל רשימת הקבוצות, ודאו שבתפריט הנפתח לצד כפתור "COMPARE" כתוב         "Align: CLUSTAL W" . אם לא, השתמשו בתפריט כדי לבחור CLUSTAL W. לאחר מכן לחצו על "COMPARE" כדי לשלוח את הרצף שלך לכלי CLUSTAL W במכון הביואינפורמטיקה האירופי בהינקסטון, בריטניה, או לשרת מקומי במעבדת Cold Spring Harbor (המחשב יקבע איזה מהם זמין בזמן), ויישר את הרצפים המסומנים. התוצאות שלך יוחזרו בחלון חדש.

10. ספרו את מספר ההבדלים בין הרצף הניאנדרטלי לרצף התלמיד/המורה:

קופסה צהובה מציינת עמדות עם הבדל נוקלאוטידים. תיבה אפורה מציינת מיקומים עם "N", שבהם לא ניתן היה לקבוע נוקלאוטיד.

קראו את הרצף וספרו את מספר הבדלי הנוקלאוטידים המודגשים בצהוב. אל תספרו שום N.

ספרו גם מקפים (-), המעידים על מחיקה - נוקלאוטיד שנעדר במיקום זה ברצף.

רשמו את מספר ההבדלים.

11. אם רצף התלמיד או המורה הניתן לקריאה אינו מכיל בסיסים רבים כמו הרצף הניאנדרטלי, השתמשו במספרי הקואורדינטות ברצף כדי להעריך את אורך האזור הדומה. אם התלמיד או המורה "קרא" היה קצר יותר מהרצף הניאנדרטלי, "נרמל" את ההבדלים בדרך זו:

הפרש מנורמל בין שני רצפים = (מספר ההבדלים שנצפו) חלקי (מספר הנוקלאוטידים במקטעי הרצפים  אשר בנמצאים בחפיפה)

12. חזרו על שלבים 9-11 כדי לבצע ארבע השוואות נוספות של הרצף הניאנדרטלי לרצף אחר של מורה או תלמיד. עבור כל השוואה זוגית, רשום את המספר הגולמי של ההבדלים ואת הערך המנורמל.

ב. כעת, קבע את מספר ההבדלים הממוצע בין שני בני אדם מודרניים. חזרו על שלבים א: 11-9 כדי להשוות חמישה זוגות של רצפי תלמידים או מורים. עבור כל השוואה זוגית, רשום את מספר ההבדלים.

ג. לאחר מכן, חזרו על שלבים א: 11-9 כדי להשוות רצף אנושי מודרני לרצף פרימטים. בעת הצגת התוצאות של ניתוחים אלה, ייתכן שתמצא יישורים המכילים שורה קצרה של מקפים. במקרים אלה, ספרו את כל רצף המקפים כהפרש נוקלאוטיד בודד.

ד. לאחר מכן, חזרו על שלבים א: 11-9 כדי לקבוע את המספר הממוצע של ההבדלים בין זוגות נבחרים של בני אדם מודרניים מגוונים. מכיוון שאנו רוצים לבדוק את התיאוריה שניאנדרטל היה אב קדמון ישיר לאירופאים המודרניים, הקפידו לכלול את הקבוצה האירופית בהשוואות שלכם.

ה. כעת חזרו על שלבים א: 11-9 כדי להשוות את הרצף הניאנדרטלי לרצפים המגוונים של האדם המודרני שבהם השתמשת בשלב ד.

ו. לאחר מכן השוו רצף אנושי באיכות טובה (כזה שאינו מכיל, או רק מעט מאוד, אותיות 'N') לכל שלושת הרצפים הניאנדרטליים בו זמנית. על ידי התבוננות מדוקדקת תגלה שהבדלי רצף מתחלקים לאחת משלוש קטגוריות:

1) הרצף האנושי שונה מהרצף הניאנדרטלי, במקום בו כל שלושת הרצפים הניאנדרטליים זהים;

2) הרצף האנושי שונה מרצף ניאנדרטלי אחד או שניים אך חולק הומולוגיה עם רצף ניאנדרטלי אחד לפחות;

3) הרצף האנושי שונה מכל שלושת הרצפים הניאנדרטליים אשר בינם לבין עצמם מראים גם שונות.

דווחו על מספר ההתרחשויות עבור כל אחת משלוש הקטגוריות הללו (1-3).

 

ז. כעת השוו את רצפי mtDNA של שני בני אדם מודרניים (למשל גרמניה מס' 1 ויפן מס' 1) לכל שלושת הרצפים הניאנדרטליים בו זמנית. ספרו את ההתרחשויות עבור כל אחת משלוש הקטגוריות הללו:

1) רצף גרמני ויפני זהים, אך שונים מרצף ניאנדרטלי אחד או יותר;

2) רצף גרמני שונה מרצפים ניאנדרטליים, הדומים לרצף היפני;

3) רצף יפני שונה מרצפים ניאנדרטליים, הדומים לרצף הגרמני.

אילו מסקנות ניתן להסיק מהתצפית שלך, במיוחד בהתייחס להנחה שייתכן שהניאנדרטלים היו אבותיהם הישירים של האירופים?

 

2. מספר ההבדלים ברצף mt מספק מדד למרחק הגנטי בין אוכלוסיות - כלומר משך הזמן שחלף התרחק מאב קדמון משותף. לפני שניתן להשתמש במוטציות mt כ"שעון מולקולרי", יש לכייל את השעון לפי התייחסות כלשהי. ההתייחסות לאבולוציה של הומינידים היא ההסתעפות המשוערת בין בני אדם לשימפנזים לפני 4 מיליון שנה.

א. בהנחה שמוטציות mt מתרחשות בקצב קבוע, השתמשו באומדן הבדל בין אדם לשימפנזה ובמספר הממוצע של הבדלי רצף שימפנזה-אנושי כדי לחשב את טווח הזמן הממוצע בין מוטציות mt. רמז: היחידה של התשובה שלך תהיה שנים/מוטציה.

ב. כעת, השתמשו בערך זה כדי לחשב זמן סטייה עבור כל בני האדם המודרניים.

ג. מדענים השתמשו במוטציות של mt ו-DNA כרומוזומליות כדי לחשב זמן ההסתעפות לבני אדם מודרניים של כ-150,000 שנה. למה המספר הזה 3-4 קטן מהחישוב שלך?

ד. כעת, חשבו את זמן ההסתעפות של האדם המודרני מהניאנדרטלי, תוך שימוש באומדן ההסתעפות של האדם המודרני של 150,000 כדי לכייל את שעון ה-MT.

ה. מה זה אומר לך על היחסים בין הניאנדרטליים לבני האדם המודרניים?

על מנת לבדוק את המסקנות שלך, יש לבקר שוב בפרק התיאוריה וב'מסתורין הניאנדרטלי' בפרקי המדיה/אנימציה.

 

 

© 2000, DNA Learning Center, Cold Spring Harbor Laboratory,

Noncommercial, educational use only.

תרגום: פרופ' ערן טאובר, המכון לאבולוציה, אוניברסיטת חיפה

http://geneticorigins.org/mito/mitoframeset.htm